绿茶

普洱熟茶是黑茶类型的一个地方性品种，具有特殊的健康调理调节作用，抗氧化、清除自由基的功效比较突出。

以下内容来自《茶叶科学》期刊2010年12月第6期第475~481页“普洱茶提取物抗氧化及其对Na2S2O3诱导HUVEC损伤的保护作用”（浙江大学茶学系，王岳飞.等）。

以普洱生茶碎茶灰和普洱熟茶碎茶灰为原料，分别制备其提取物，以茶多酚为对照，测定ABTS自由基清除能力和铁离子还原能力FRAP，评价提取物的抗氧化作用；并以Na2S2O3损伤细胞HUVEC为模型，初步探讨两种提取物对HUVEC氧化损伤的保护作用。

一、方法

1、提取物制备

普洱生茶和普洱熟茶的碎灰茶原料，分别以茶水比1:10在沸蒸馏水中连续浸提2次，每次浸提时间为10min，合并浸提液，减压浓缩后喷雾干燥，得到淡黄色和灰褐色粉末，分别为普洱生茶提取物样品和普洱熟茶提取物样品。

2、ABTS自由基清除能力测定

用去离子水将准确称取的3.8408g的ABTS定容至1.0L，使ABTS浓度达到7mmol/L，加入准确称取的0.6623g过硫酸钾，使过硫酸钾的浓度为2.45mmol/L。室温避光条件下静置过夜（12~16h），将ABTS自由基储存液用水稀释至734nm处吸光度为0.70±0.02的应用液。

测定应用液在734nm处的吸光值Ablank，将样品配成20、40、60、80、100μg/mL待测液，各取100μL加入3mL的ABTS应用液，充分混合，室温下避光反应6min后测定其在734nm处的测吸光值Asample（10min内吸光度稳定）。所有实验重复3次，计算ABTS自由基清除率。

3、还原铁离子能力测定

取300mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH3.6）25mL，10mmol/L浓度TPTZ的HCl溶液2.5mL与20mmol/L的FeCl3溶液2.5mL，混匀，该溶液为FRAP工作液，测定其在593nm的吸光值Aq（反应前），作为对照；以0.1~2.0mmol/L的FeSO4与0.5mL的10mmol/L浓度TPTZ的HCl溶液和5mL的300mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH3.6）的混合液进行混合，于593nm下测定吸光值。

以FeSO4溶液的浓度为纵坐标，吸光值为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程：y=563.16 x -13.117，R2=0.9995。分别取质量浓度为20、40、60、80、100μg/mL待测液的待测样2 mL加入到15mL的FRAP工作液中，8min后于593nm处测定吸光值Ah（反应后）。由Ah减去Aq的差值在标准曲线上获得抗氧化物相应的FeSO4的浓度，定义为FRAP值。FRAP值越大，表明还原铁离子能力越强。所有实验重复3次。

4、细胞培养及分组

HUVEC用含10%胎牛血清，100IU/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养，用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化、传代，每3d更换一次培养基，取对数生长期细胞，以104~106个细胞/mL，100μL/孔，接种于96孔板，以用于实验研究。

细胞分三组：空白对照组；Na2S2O3损伤组（终浓度分别为：2、4、6、8、10mmol/L）；样品处理组（样品+Na2S2O3），茶多酚、普洱熟茶、普洱生茶样品都各设3个处理浓度，分别为0.2、0.6、1mg/mL，Na2S2O3终浓度同上。

5、细胞存活率测定

分组处理HUVEC在37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，吸出培养液，加0.5mg/mL的MTT后继续培养4h，至紫色结晶完全，吸出孔内培养液，加入DMSO（150μL/孔），将96孔板置于微孔板振荡器震荡10min，使结晶溶解，酶标仪检测490nm下吸光值。

二、结果

①提取物的主要化学成分

普洱生茶、普洱熟茶提取物的化学成分差异较明显，其中，普洱生茶的茶多酚、可溶性总糖、氨基酸和儿茶素含量都明显高于普洱熟茶，特别是茶多酚含量高出普洱熟茶1倍多，儿茶素总量更是远远高于普洱熟茶。

普洱生茶提取物中儿茶素含量最高的是ECG和EGCG，分别达到68.8mg/g和66.5mg/g，普洱熟茶提取物的儿茶素单体中未能检测出EGCG和GCG。普洱生茶中咖啡碱的含量低于普洱熟茶。

②对ABTS自由基清除率：

茶多酚与普洱生茶、普洱熟茶碎茶灰水提物清除ABTS自由基能力随着浓度的增加，清除能力逐渐增强。并在20~100μg/mL范围内，浓度与清除率呈现良好的线性关系。

3种物质清除ABTS自由基能力，由强到弱顺序为：茶多酚>普洱生茶水提取物>普洱熟茶水提物。

根据量效关系式：y（茶多酚）=22.336Ln(x)-39.539，R2=0.9479；y（普洱生茶）=21.806Ln(x)-46.586，R2=0.9542；计算得半数清除率浓度IC50分别为55.08μg/mL和83.88μg/mL。

在实验浓度范围内普洱熟茶提取物对ABTS自由基清除能力较弱，最高清除率尚未达到50%。

③铁离子还原能力

在FRAP实验中，FRAP值反应了物质的还原铁离子的能力，FRAP值越大，其还原能力越强。茶多酚与普洱生茶、普洱熟茶碎茶灰提取物均表现出一定的还原铁离子能力，并随着浓度的增加，还原铁离子能力逐渐增强。并在20~100μg/mL范围内，质量浓度与清除率呈现良好的线性关系。三种物质还原铁离子能力大小：茶多酚>普洱生茶水提取物>普洱熟茶水提物。

④对Na2S2O3诱导损伤细胞HUVEC的保护

用浓度梯度2~10mmol/L的Na2S2O3处理细胞HUVEC为24h，MTT法检测细胞存活率，建立损伤模型。Na2S2O3明显损伤HUVEC，所有处理都呈剂量依赖性地抑制了HUVEC的生长，细胞存活率随处理浓度的增加而逐渐降低，所有浓度损伤均达到显著水平。

在各浓度Na2S2O3中分别加入0.2、0.6、1.0mg/mL茶多酚、普洱生茶提取物、普洱熟茶提取物后表现为不同的细胞存活率，茶多酚、普洱生茶提取物、普洱熟茶提取物均能不同程度地提高HUVEC的存活率，对细胞的Na2S2O3损伤具有一定的保护作用，并且3种物质的保护作用呈现一定差异。

3种物质对细胞HUVEC的保护作用，随着浓度的提高而增强，当质量浓度为0.2mg/mL时，3种物质对8mmol/L的Na2S2O3处理的细胞存活率提高均达到显著水平；当3种物质质量浓度为0.6mg/mL时，对6mmol/L的Na2S2O3损伤的细胞存活率提高与对照相比达到显著水平。当质量浓度达到1.0mg/mL时，3种物质对6、8、10mmol/L的Na2S2O3损伤细胞存活率的提高均达到显著水平，其中，在8mmol/L时Na2S2O3损伤细胞中达到极显著水平。

在3种物质中，茶多酚对细胞HUVEC的保护作用最好，而普洱熟茶提取物对HUVEC的保护作用要明显高于普洱生茶提取物，并在质量浓度为0.6mg/mL时对6mmol/L的Na2S2O3损伤，与在质量浓度为1.0mg/mL时，对4mmol/L和6mmol/L的Na2S2O3损伤的细胞的保护作用与同浓度的茶多酚相当。

三、结论

在体外抗氧化作用的FRAP和ABTS两个评价体系中，普洱熟茶提取物的抗氧化能力最弱，其次是普洱生茶，作为对照的茶多酚显示最好的抗氧化能力，这表明，虽然普洱茶中具有一些特异性抗氧化物质，但是含量较低，在细胞体外抗氧化能力评价中，儿茶素含量是最具决定性的因素。

Na2S2O3诱导细胞HUVEC损伤模型中，普洱生茶、普洱熟茶提取物对细胞HUVEC存活率的提高不一，而且浓度的不同和损伤程度的不同所显示的保护程度也不同，发现儿茶素含量较低的普洱熟茶提取物的保护作用要高于普洱生茶，并且在一些特定浓度上与同浓度茶多酚相当。

推测可能是细胞外体系中，提取物中儿茶素等活性成分可以全部参与反应，而在细胞内体系中，成分需通过细胞膜才能发生相关作用。茶多酚和普洱生茶中儿茶素等抗氧化物质含量虽高，但未必能全部进入细胞，而普洱熟茶中一些特异性物质，虽然含量极低，却能够在细胞体系中更容易透过细胞膜进入细胞，发挥保护作用。